Polymerase chain reaction là gì? Các công bố khoa học về Polymerase chain reaction

Chúng tôi mô tả một phương pháp phân tử mới để phân tích đa dạng di truyền của các quần thể vi sinh vật phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên việc tách biệt các đoạn gene mã hóa cho 16S rRNA, có cùng chiều dài, được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua điện di gel gradient biến tính (DGGE). Phân tích DGGE của các cộng đồng vi sinh vật khác nhau cho thấy sự hiện diện của tối đa 10 băng phân biệt trong mẫu tách, nhiều khả năng đến từ nhiều loài khác nhau cấu thành các quần thể này, và do đó tạo ra một hồ sơ DGGE của các quần thể đó. Chúng tôi đã chỉ ra rằng có thể xác định các thành phần chỉ chiếm 1% tổng số quần thể. Với một probe oligonucleotide đặc hiệu cho vùng V3 của 16S rRNA của vi khuẩn khử sulfate, một số đoạn DNA cụ thể từ một số quần thể vi sinh vật có thể được xác định thông qua phân tích lai ghép. Phân tích DNA gen của một màng sinh học vi khuẩn phát triển dưới điều kiện hiếu khí cho thấy rằng vi khuẩn khử sulfate, bất chấp tính kỵ khí của chúng, vẫn hiện diện trong môi trường này. Các kết quả mà chúng tôi thu được chứng tỏ rằng kỹ thuật này sẽ góp phần vào việc hiểu biết về đa dạng di truyền của các quần thể vi sinh vật chưa được mô tả.

Cần có những phương pháp hiệu quả để xác định và tách biệt những gen có biểu hiện khác nhau trong các tế bào khác nhau hoặc trong các điều kiện thay đổi. Báo cáo này mô tả một phương pháp để phân tách và nhân bản các RNA thông tin (mRNA) riêng lẻ thông qua phản ứng chuỗi polymerase. Yếu tố chính là sử dụng một bộ các mồi oligonucleotide, một mồi được gắn vào đuôi polyadenylate của một tập hợp con mRNA, và mồi còn lại ngắn và có trình tự ngẫu nhiên để nó có thể liên kết tại các vị trí khác nhau tương ứng với mồi đầu tiên. Các phân nhóm mRNA được định nghĩa bởi các cặp mồi này đã được tăng cường sau khi phiên mã ngược và được tách biệt trên một gel kết hợp DNA. Khi sử dụng nhiều bộ mồi, các mẫu DNA bổ sung đã được khuếch đại cho thấy các mẫu lặp lại có được, có sự phụ thuộc mạnh vào tính đặc hiệu của trình tự tại từng mồi.

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là phương pháp nhạy nhất để phát hiện mRNA với số lượng thấp, thường thu được từ các mẫu mô hạn chế. Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật phức tạp, có nhiều vấn đề đáng kể liên quan đến độ nhạy, tính tái sản xuất và tính đặc hiệu của nó, và với tư cách là một phương pháp định lượng, nó gặp phải những vấn đề vốn có trong PCR. Sự ra đời gần đây của các quy trình RT-PCR động học dựa trên huỳnh quang đã đơn giản hóa đáng kể quá trình tạo ra sự định lượng mRNA tái sản xuất và hứa hẹn sẽ khắc phục những hạn chế này. Tuy nhiên, việc áp dụng thành công của chúng phụ thuộc vào sự hiểu biết rõ ràng về các vấn đề thực tiễn, và thiết kế thí nghiệm, ứng dụng và xác thực cẩn thận vẫn là điều cần thiết để đo lường định lượng chính xác sự phiên mã. Bài đánh giá này thảo luận về các khía cạnh kỹ thuật liên quan, tương phản giữa các phương pháp RT-PCR thông thường và động học trong việc định lượng biểu hiện gen và so sánh các hệ thống RT-PCR động học khác nhau. Nó minh họa sự hữu ích của những xét nghiệm này bằng cách chứng minh sự khác biệt đáng kể về mức độ phiên mã giữa các cá thể trong họ gen housekeeping, dehydrogenase glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH).

Hoạt tính exonuclease 5'----3' của enzyme ổn nhiệt DNA polymerase Thermus aquaticus có thể được sử dụng trong hệ thống phát hiện sản phẩm của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện được đồng thời với quá trình khuếch đại. Một probe oligonucleotide, không thể kéo dài ở đầu 3', được đánh dấu ở đầu 5', và được thiết kế để kết hợp với trình tự mục tiêu, được đưa vào thí nghiệm PCR. Sự liên kết của probe với một trong các sợi sản phẩm của PCR trong quá trình khuếch đại tạo ra một cơ chất phù hợp cho hoạt tính exonuclease. Trong quá trình khuếch đại, hoạt tính exonuclease 5'----3' của enzyme DNA polymerase T. aquaticus phân hủy probe thành các mảnh nhỏ hơn có thể phân biệt được với probe chưa bị phân hủy. Thí nghiệm này nhạy cảm và cụ thể, và là một cải tiến đáng kể so với các phương pháp phát hiện phức tạp hơn.

Chúng tôi báo cáo về việc phát triển và ứng dụng của một phương pháp kiểm tra nhanh để phát hiện và phân loại virus dengue. Các mồi oligonucleotide đồng thuận đã được thiết kế để gắn kết với bất kỳ trong bốn loại virus dengue nào và khuếch đại một sản phẩm 511-bp trong một phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược (PCR). Đầu tiên, chúng tôi đã tạo ra một bản sao cDNA của một phần của bộ gen virus trong một phản ứng sao chép ngược với sự hiện diện của mồi D2 và sau đó thực hiện một PCR tiêu chuẩn (35 chu kỳ biến tính nhiệt, gắn kết và kéo dài mồi) với sự bổ sung của mồi D1. Sản phẩm DNA sợi kép kết quả từ RT-PCR đã được phân loại bằng hai phương pháp: lai chấm của sản phẩm 511-bp đã được khuếch đại với các đầu dò đặc thù loại virus dengue hoặc một đợt PCR khuếch đại thứ hai (PCR lồng) với các mồi đặc thù theo loại, tạo ra sản phẩm DNA có kích thước duy nhất chẩn đoán được cho từng kiểu huyết thanh của virus dengue. Dữ liệu tích lũy đã cho thấy rằng virus dengue có thể được phát hiện và phân loại chính xác từ các mẫu huyết thanh người đang trong giai đoạn viremia.

Phân đoạn gen rotavirus mã hóa glycoprotein chính lớp vỏ capsid ngoài VP7 đã được khuếch đại trực tiếp từ mẫu phân bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). RNA hai sợi được chiết xuất từ mẫu phân đã được sử dụng làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược, sau đó tiếp diễn trong cùng một hỗn hợp phản ứng với sự khuếch đại, sử dụng polymerase Taq. Nhiều điều kiện khác nhau đã được kiểm tra để tối ưu hóa sản lượng gen được khuếch đại. Nồng độ MgCl2, dimethyl sulfoxide, và RNA khuôn mẫu là các yếu tố quan trọng. Việc lựa chọn cặp mồi cho phép khuếch đại toàn bộ phân đoạn hoặc các phần cụ thể. Bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu kiểu loại có nguồn gốc từ các vùng khác nhau trên gen, chúng tôi đã phát triển một phương pháp định kiểu PCR mà mỗi kiểu huyết thanh virus của người tạo ra một kích thước phân đoạn đặc trưng, dễ nhận biết trong gel agarose. Phương pháp định kiểu PCR đã được áp dụng cho 10 chủng chuẩn rotavirus, bao gồm tất cả 6 kiểu huyết thanh của người đã biết (kiểu huyết thanh 1, 2, 3, 4, 8 và 9), và cho 34 mẫu phân đã được định kiểu huyết thanh trước đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng. Có sự tương quan tuyệt đối giữa các phương pháp sinh học phân tử và huyết thanh học. Ngoài ra, 14 mẫu phân không thể phân định kiểu huyết thanh bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng có thể được phân định kiểu bằng phương pháp PCR. Ngoài ứng dụng cho việc phát hiện và định kiểu rotavirus trực tiếp từ phân, phương pháp PCR cung cấp một phương tiện nhanh chóng và hiệu quả để thu được số lượng lớn cDNA thích hợp cho việc giải trình tự, nhân bản và các nghiên cứu di truyền khác, không cần thiết phải nuôi cấy tế bào và tinh sạch virus.